„Genschere“: Synthetische CRISPR-gRNAs schneiden fast immer

Neue Studie zeigt auf, welche Faktoren eine effiziente und präzise Geneditierung sowie eine versteckte DNA-Reparatur ermöglichen

Auf den Punkt gebracht

• Synthetische guide-RNAs (gRNAs) schneiden effektiver als erwartet: Chemisch synthetisierte gRNAs, die für die CRISPR-Genom-Editierung hergestellt werden, sind weniger von der Ziel-DNA-Sequenz beeinflusst als gRNAs, die von DNA-Vorlagen transkribiert werden. Dies führt zu vorhersehbareren gRNA Aktivitäten.
• Robuste Vorhersagbarkeit für synthetische Cas9-gRNA-Aktivität und HDR-Effizienz: Das EVA-Score-Modell kann die Aktivität synthetischer gRNAs in verschiedenen Zelltypen zuverlässig vorhersagen und die Effizienz der homologiegesteuerten Reparatur (HDR) anhand weniger Sequenzmerkmale prognostizieren. Diese Werkzeuge helfen Forschenden dabei, Genom-Editierungsstrategien planbarer und effektiver zu gestalten.
• Neue Erkenntnisse zu CRISPR-Reparaturwegen und Sicherheit: Die Studie zeigt versteckte DNA-Reparaturereignisse auf und belegt, dass Cas12a im Vergleich zu Cas9 deutlich weniger großskalige genomische Veränderungen verursacht. Dies deutet darauf hin, dass Cas12a bei klinischen Anwendungen der Genom-Editierung die sicherere Option sein könnte.

Im Gegensatz zu bisherigen Vorhersagetools, die auf transkribierten gRNAs basierten und daher durch Sequenzpräferenzen der RNA-Polymerasen beeinflusst waren, konzentriert sich die neue Aktivitätsvorhersage auf synthetische gRNAs – ein Format, das in der Forschung weit verbreitet und prädistiniert für klinische Anwendungen ist. Die Autoren entwickelten ein einfaches lineares Modell, den sogenannten EVA-Score, der die Aktivität von gRNAs zuverlässig über verschiedene Zelltypen und Datensätze hinweg vorhersagen kann.

„Während transkribierte gRNAs oft durch ihre Sequenz ausgebremst werden, bleibt die Leistung synthetischer gRNAs davon weitgehend unbeeinflusst“, sagt Stephan Riesenberg, der die Studie leitete. „Diese Unterschiede, kombiniert mit einer genaueren Quantifizierung zellulärer Folgen nach dem CRISPR-DNA Schnitt, haben es uns ermöglicht, ein einfaches, aber leistungsfähiges Vorhersagemodell zu entwickeln.“ Die EVA-Scores für alle gRNAs im menschlichen Genom und Maus-Genom sind bequem über online Genome-Browser-Tracks abrufbar.

Neben der gRNA-Aktivitätsvorhersage beschreibt die Studie auch ein neues Modell zur Vorhersage der Effizienz von homologiegesteuerter Reparatur (HDR) – ein hilfreiches Werkzeug für präzise Genomkorrekturen, etwa bei Punktmutationen. Die Forschenden identifizierten Sequenzmerkmale, die den HDR-Erfolg wesentlich beeinflussen, wie zum Beispiel die Faltung der DNA-Matrizensequenz und die Art der gewünschten Nukleotidänderung. Unter optimalen Bedingungen lassen sich so HDR-Effizienzen von bis zu 78 Prozent erreichen.

Darüber hinaus geht die Studie auf Sicherheitsaspekte ein, die für therapeutische Anwendungen entscheidend sind. Durch die Analyse der Schnittmuster von CRISPR-Cas9 und Cas12a entdeckten die Forschenden eine hohe Prävalenz versteckter Reparaturereignisse - genomische Veränderungen, die von standardmäßigen PCR-basierten Tests nicht erkannt werden, darunter große Deletionen und perfekt reparierte Brüche, die von unveränderter DNA nicht zu unterscheiden sind. Interessanterweise zeigt Cas12a eine deutlich geringere Neigung zu großen DNA-Veränderungen und bevorzugt stattdessen perfekte Reparatur – ein möglicher Vorteil für den Einsatz in der Gen-Therapie. Die strukturellen Unterschiede in der DNA-Spaltung – Cas12a erzeugt versetzte, sogenannte "sticky ends" – könnten diese unterschiedlichen Reparaturverläufe erklären.

Die Ergebnisse dieser Studie bieten wertvolle Werkzeuge für die Forschung und Anwendung von CRISPR-Technologien – mit dem Ziel, Genom-Editierung effektiver und sicherer zu machen.